Рапид и пятно - Тайваньская компания шагового водителя, ООО

Nature Biomedical Engineering, том 7, страницы 1040–1052 (2023 г.) Процитировать эту статью

4259 Доступов

110 Альтметрика

Подробности о метриках

Анализ бляшек — золотой стандарт для измерения концентрации компетентных к репликации литических вирионов — требует окрашивания и обычно занимает более 48 часов. Здесь мы показываем, что безлинзовая голографическая визуализация и глубокое обучение могут быть объединены для ускорения и автоматизации анализа. Компактное устройство визуализации фиксирует фазовую информацию без меток со скоростью примерно 0,32 гигапикселя в час на лунку, охватывает площадь около 30 × 30 мм2 и имеет в 10 раз больший динамический диапазон концентрации вируса, чем стандартные анализы, а также количественно определяет количество инфицированных. площадь и количество бляшкообразующих единиц. Для вируса везикулярного стоматита автоматизированный анализ бляшек выявил первые события лизиса клеток, вызванные репликацией вируса, уже через 5 часов после инкубации, а менее чем через 20 часов он обнаружил бляшкообразующие единицы с частотой выше 90% при 100% специфичность. Кроме того, он сократил время инкубации вируса простого герпеса 1 типа примерно на 48 часов, а вируса энцефаломиокардита примерно на 20 часов. Бесцветный анализ должен быть пригоден для использования в вирусологических исследованиях, разработке вакцин и клинической диагностике.

Вирусные инфекции могут поражать миллионы людей во всем мире через инфекционные заболевания, такие как грипп, вирус иммунодефицита человека и вирус папилломы человека1. По оценкам Центров США по контролю и профилактике заболеваний, с 2010 года вирус гриппа стал причиной 16–53 миллионов заболеваний, 0,2–1 миллиона госпитализаций и 16 700–66 000 смертей только в Соединенных Штатах2,3. Кроме того, пандемия COVID-19, вызвавшая более 500 миллионов случаев заражения и более 6 миллионов смертей во всем мире, легла огромным бременем на общественное здравоохранение и социально-экономическое развитие многих стран4. Чтобы помочь справиться с такими глобальными проблемами здравоохранения, необходимо разработать точные и недорогие методы количественного определения вируса для клинической диагностики5, разработки вакцин6 и производства рекомбинантных белков7 или противовирусных агентов8,9.

Анализ бляшек, разработанный в 1952 году, стал первым методом количественного определения концентрации вируса. Этот метод, разработанный Ренато Дульбекко, позволяет вручную определить количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) в данном образце, содержащем компетентные к репликации литические вирионы10,11. Эти образцы серийно разводятся, и аликвоты каждого разведения добавляются в чашку с культивируемыми клетками10. По мере того, как вирус заражает соседние клетки и распространяется, постепенно формируется бляшка, которую может визуально осмотреть эксперт. Благодаря своей уникальной способности экономически эффективно обеспечивать инфекционность вирусных образцов, анализ бляшек остается золотым стандартом для количественного определения концентрации вируса, несмотря на существование других методов12,13,14,15,16,17 ,18,19, такие как иммунофлуоресцентные анализы фокального формирования14, полимеразная цепная реакция16 и анализы на основе твердофазного иммуноферментного анализа19,20. Однако для анализа бляшек обычно требуется инкубационный период продолжительностью 2–14 дней (в зависимости от типа вируса и условий культивирования)21, чтобы позволить бляшкам увеличиться до видимых размеров, и возможны ошибки человека во время процесса ручного подсчета бляшек22. Для улучшения традиционных методов анализа бляшек были разработаны многочисленные методы23. Хотя многие системы обладают уникальными возможностями для визуализации клеточных культур в луночных планшетах, для них требуются либо флуоресцентные маркеры22, либо специальные культуральные планшеты с золотыми микроэлектродами24. Кроме того, человеческие ошибки при подсчете по-прежнему остаются проблемой для этих методов. Таким образом, точный, количественный, автоматизированный, быстрый и экономически эффективный анализ бляшек будет полезен для вирусологических исследований и связанных с ними клинических применений.

Некоторые из последних разработок в области количественной фазовой визуализации (QPI), голографии и глубокого обучения дают возможность удовлетворить эту потребность. QPI — это выдающийся метод визуализации, который позволяет визуализировать и количественно оценивать прозрачные биологические образцы неинвазивным способом и без использования меток25,26. Кроме того, качество изображения систем QPI можно повысить с помощью нейронных сетей за счет улучшения, в частности, фазового поиска27, шумоподавления28, автофокусировки29,30 и пространственного разрешения31. Кроме того, с использованием QPI32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42 были продемонстрированы многочисленные методы обнаружения и идентификации микроорганизмов на основе глубокого обучения.

90% PFU detection rate in <20 h, providing major time savings compared with the traditional plaque assays, which take ≥48 h. Furthermore, we show an average incubation time saving of ~48 h and ~20 h for HSV-1 and EMCV, respectively, achieving a PFU detection rate >90% with 100% specificity. A quantitative relationship was also developed between the incubated virus concentration and the virus-infected area on the cell monolayer. Without any extra sample-preparation steps, this deep-learning-enabled label-free PFU imaging and quantification device can be used with various plaque assays in virology and might help to expedite research in vaccine and drug development./p>95% coverage. During the virus infection, five wells were infected by 100 µl of the diluted VSV suspension (obtained by diluting a 6.6 × 108 PFU ml−1 VSV stock with a dilution factor of 2−1 × 10−6), and one well was left for negative control. Then, 2.5 ml of the overlay solution containing the total medium with 4% agarose was added to each well (see Methods for details, ‘Preparation of agarose overlay solution’). After the solidification of the overlay at room temperature, each sample was first placed into our imaging set-up for 20 h of incubation, performing time-lapse imaging to capture the spatiotemporal information of the sample. Then, the same sample was left in the incubator for an additional 28 h to let the PFUs grow to their optimal size for the traditional plaque assay (this is only used for comparison purposes). Finally, each sample was stained using crystal violet solution to serve as the ground truth to compare against our label-free method./p>90% at 20 h of incubation without having any false positives at any time point despite using no staining./p>1%), a faster PFU concentration readout can be provided at 12 h or 15 h. As the size of an average PFU on the well is physically larger at 15 h of incubation compared with 12 h, the slope of the red calibration curve in Fig. 6b is smaller than in Fig. 6a, as expected. For samples with even higher virus concentrations, the infected cell area percentage could reach >1% in ≤10 h of incubation (shown in Fig. 5c), providing the PFU concentration readout even earlier./p>70 °C during its operation, which could disturb the growth of the sample and vaporize the agarose layer, especially for regions that are near the sensor parking location between successive holographic scans. Hence, a cooling system was built using fans (QYN1225BMG-A2, Qirssyn). We also sealed the sides of the sample using parafilm (product number 13-374-16, Fisher Scientific) and opened four holes on the top cover to form a gentle ventilation system, which is an inexpensive and easy-to-implement solution to avoid sample drying./p>90% detection rate for VSV PFUs with 100% specificity in <20 h./p>11 TB) is available from the corresponding author on reasonable request./p>